Optimización de la regeneración in vitro del olmo utilizando explantes de hoja y evaluación del proceso en experimentos de transformación

Resumen

Se ha desarrollado un procedimiento para la regeneración del olmo híbrido «Sapporo» resistente a la grafiosis mediante el uso de discos foliares procedentes de plantas cultivadas in vitro y examinadas en ensayos de transformación. Para ello se requirieron dos pasos: inducción de las yemas (3 semanas), seguido de la elongación de las yemas (4 semanas). Los meristemas que dieron origen a las yemas se formaron en la cercanía de las costillas de corte a partir de diversos tejidos (floema, procámbium, parénquima) excepto la epidermis. La regeneración dependió del uso de agarosa (6 g/l LSM) y de medio MS diluido (1/2). Los mejores resultados (11-14 yemas por explante) se obtuvieron en presencia de 0,1 μM de TDZ y 0,06 μM de IAA y cuando la maltosa (55-110 mM) o el sorbitol (110 mM) se usaron como fuente de carbohidratos. Durante la elongación del tallo, el TDZ hubo de ser disminuido a 0,01 μM o sustituido por 1-2 μM de BAP y 1,4 μM de GA3. En esta fase fue necesaria una mezcla de 55 mM de sorbitol y 27,5 mM de maltosa. Se desarrollaron al menos 7 tallos por explante que fácilmente enraizaron (96%) y se aclimataron cuando se añadió sorbitol (27,5 mM) y carbón activo (2 g/l) al medio de enraizamiento. Los ensayos de transformación se desarrollaron con las cepas GV3101-pMP90 (pKyGUSintron) de Agrobacterium tumefaciens. Las zonas de regeneración presentaron una expresión GUS estable. No obstante, todas las yemas cultivadas in vitro murieron en un medio selectivo de enraizamiento (50 mg/l de kanamicina). Cuando se intentó la selección in vitro (12,5 mg/l de kanamicina), algunas yemas se iniciaron pero la elongación fue impedida. La susceptibilidad a la neomicina parece ser muy alta, por lo que los marcadores y los pasos de selección deben ser cuidadosamente revisados.